CRISPR-CAS9的定向演变增加了特异性

在以前的CRISPR研究和基因编辑方法上，李德博士和工具博士的研究和基因编辑方法开发了一种筛选多个CAS9变体的方法。它们的方法旨在快速有效地筛选Cas9的许多突变，以找到具有最大化的目标活性的一个具有最大化的目标活性并最小化的偏离目标活动。在成功开发和实施系统时，狙击屏幕，发现了合适的CAS9变体：狙击CAS9。

我们的DNA控制着我们生活的许多元素，DNA的任何缺陷都会对我们的健康产生巨大影响。到目前为止，修复我们DNA中的缺陷是非常困难的;然而，随着基因编辑技术的出现，这被带入了可能的领域。

使用CRISPR编辑基因
一种这样的基因编辑技术是CRISPR:聚集的定期间隔短回文重复。CRISPR是一种简单但功能强大的基因组编辑工具，已经获得了科学家们的广泛关注。CRISPR技术使研究人员能够轻松地改变DNA序列，从而改变基因功能。

虽然基因编辑技术确实代表了科学社区之间的重大努力，但已经存在类似的基因组编辑系统的示例。目前可用的最通用和基因组的最精确和精确方法之一是CRISPR CAS9，其由在细菌中发现的天然存在的系统调整。

当然发生的Crisp Cas9
在自然界中，CRISPR Cas9充当细菌抵御入侵病毒的免疫系统。自然产生的Cas9可以作为开发用于人类的合适疗法的一个极好的模板，但它确实有一些缺陷。Cas9对其能保护的病毒具有较高的特异性，但由于病毒容易发生自发突变，因此对其不利。如果Cas9具有高度特异性，那么它将不能应对病毒突变，然而，特异性混杂的Cas9可以继续有效。因此，人们认为在自然界中发现的Cas9序列极有可能表现出混杂的特异性。

在ToolGen的Jungjoon Lee博士和他的同事进行的最新研究的目标是能够筛选大量的Cas9变异具有最佳数量的特异性，以开发一种修改人类基因功能的疗法。

该研究小组
李博士是第33届国际化学奥林匹克运动会的英国代表，并获得银牌。后来，他在剑桥皇后学院(Queens ' College)获得了本科学位，在斯坦福大学(Stanford University)获得了博士学位。学习结束后，他加入了Samsung Advanced Institute of Technology (SATI)，支持Samsung Biologics的目标发现项目。李教授随后加入了初创公司Toolgen，目前担任平台开发研究主管。

在这项最新的工作中，Lee博士得到了ToolGen、Joonsun Lee、Min-hee Jung和Eulhwan Jeong的同事以及Jin-Soo Kim教授的支持。本研究由韩国政府基础科学研究所、韩国科学与信息技术部和韩国国家研究基金会资助。

在自然界中，CRISPR Cas9充当细菌抵御入侵病毒的免疫系统。

基于以前的研究
在这项研究中，该团队开发了一种筛选广泛突变的CAS9变体的方法，以寻求具有用于人类治疗的最佳特性的方法。理想特性包括高水平的“靶”理想效果和低水平的“脱靶”效果。这意味着将寻求在人类医疗保健中使用具有高特异性的变体。这与Cas9具有混杂特异性的自然趋势相矛盾，因为这是本质上的好处。随着CAS9修改基因，重要的是，研究人员可以控制哪些基因进行编辑并理解在实施治疗之前将发生的内容。

为了开展这项研究，ToolGen的研究人员需要在之前的工作基础上，探索不同方法的几个元素，这些方法可以用来最小化野生型Cas9的不良影响。

例如，以往的研究表明，利用截断的单引导rna (sgRNAs)来指导基因发育可以获得更高的特异性。sgRNA是一种单RNA分子，它包含一个定制的短crRNA序列与支架tracrRNA序列融合。该团队还利用研究表明，将Cas9从质粒形式转移到核糖核蛋白(RNP)形式可以实现更高的特异性。

为了能够筛选最广泛的Cas9变种，该团队建立在之前识别Cas9改良变种的研究基础上。例如，在化脓性链球菌Cas9 (SpCas9)中，蛋白质的特定氨基酸残基被修饰。在其他研究中，也探讨了筛查的方法。在这个早期的研究中，特异性最高的Cas9变异是用酵母或酵母鉴定的大肠杆菌筛选系统。以前的研究表明大肠杆菌筛选系统比酵母系统具有更快的倍增时间和更高的转化效率大肠杆菌．

许多组先前已经报道了使用设计设计的Cas9变体，以使Cas9和基材之间的非特异性相互作用表现出低的目标活性。虽然最小化偏离目标活动是非常重要的，但它同样重要的是，目标活动不会受到损害，或者变体将根本不起作用。

在回顾和评估了之前的研究后，ToolGen的团队开发了一个大肠杆菌基于定向进化系统筛选随机突变的Cas9变异，同时确保脱靶活性最小化和特异性增加。

使用狙击屏
Lee和Toolgen团队选择将他们的方法命名为Sniper-Screen，以反映他们的方法在寻找目标Cas9的优化特异性和保留目标活性方面所能达到的高水平准确性。

通过将正筛选系统和负筛选系统相结合，Cas9的靶上和靶外效应可以自发演化。狙击筛选是基于三个不同的质粒和一个感兴趣的基因整合到大肠杆菌基因组。研究这些变体所需的复杂过程需要几个步骤。

利用Sniper-Screen Lee和他的同事们成功识别出了一种Cas9变种，它有三种突变，称为
Sniper-Cas9……

重要的是，在他们的方法中，Cas9变体在一个低拷贝数质粒的CMV-PltetO1双启动子系统下表达，因此候选基因在大肠杆菌可以在哺乳动物细胞中进行测试，而不需要亚克隆。这有助于确保该方法可以尽可能有效地完成。

然后使用TN7转座子系统将感兴趣的基因引入大肠杆菌基因组中。含有温度敏感的复制起源的SGRNA质粒表达了SGRNA以指导靶向感兴趣的基因的发展，然而，感兴趣序列的SGRNA和基因并不完全匹配。

在含有ccdB基因的第三个质粒上存在一个完全匹配的sgRNA靶位点，该质粒编码一种致命的产物，可使酶旋转酶中毒并促进双链断裂。在狙击筛选中，表达高脱靶活性Cas9变体的细胞被去除，因为双链断裂被引入基因组DNA的错配位点。同时，表达低靶点活性Cas9变体的细胞也因为致命而被移除ccdB基因的表达。通过改变无水四环素(anhydro四环素，ATC)的浓度，可以改变Cas9的表达水平，从而调节选择力。

它为什么工作？
工具团队计算出在基因组DNA中定位错配的SGRNA靶位点，而不是质粒将增加系统的敏感性。这种方法的优点在于只有一个基因组遗址，而存在许多质粒，每个质粒含有靶位点，在单个中大肠杆菌细胞。

通过Sniper-Screen, Lee和同事成功识别出一种带有三种突变的Cas9变体，称为Sniper-Cas9，它显示了野生型的靶上活动水平和减少的脱靶活动。Sniper-Cas9可以通过使用截断的sgRNAs或基于rnp的递送而不是基于质粒递送达到更高的特异性比率。

ToolGen团队利用了他们所掌握的所有资源，包括对野生型Cas9特性的全面回顾，并在之前的研究基础上实现了他们的预期结果。CRISPR基因技术是一个发展迅速的领域，李开复和他的团队所进行的工作将确保这些发展背后的动力能够继续建立。