新型3D显微镜提供了前所未有的生物过程的运动图像

德州大学埃尔帕索分校的李春强博士和他的团队开发了一种新型的三维光学显微镜，它使用光谱形状的脉冲激光。大多数之前的显微镜使用扫描来实现高速2D成像，而李博士的方法是通过一种叫做“时间聚焦”的技术来获得z轴位置，这种技术利用“衍射”环和聪明的数学来推断z轴位置。

李博士和他的合作团队在光学显微技术上取得了突破，可用于不使用光栅扫描激光束的三维成像。他希望在微观尺度上观察活细胞之间的相互作用。李博士的方法将允许细胞和分子活动，如蛋白质运动，亚细胞信号，和病毒感染被实时检测和捕获。

该团队建立在该领域其他人的工作基础上，他们试图以3D方式成像微小的“粒子”、分子或细胞的轨迹，精确度为一纳米，或一米的十亿分之一。

理解三维显微镜
早期的显微镜主要依靠三种技术中的一种来捕捉3D轨迹。第一种是使用一种被称为“反馈”的控制机制，利用激光束扫描来跟踪单个粒子在所有三个维度上的运动。第二种技术是利用被聚焦的光点照亮的图像的形状变化，称为“点扩散函数”来计算z位置。最后一种方法是利用散焦图像的光衍射。与之前的方法不同，合成图像包含同心环，并且可以从环的半径和中心高精度地确定z位置。

埃尔帕索的团队
李博士和他的团队开发了一种创新的显微镜，可以使用荧光跟踪多个粒子。荧光是从目标“粒子”被检测到的光学技术经常使用在显微镜称为“双光子激发”。在这种方法中，样品被贴上标签，当被激光束激发时，会发出特定颜色的光。成形的超快激光脉冲照亮了要捕捉的场景，用显微镜的术语来说，每边100µm，或一米的百万分之一。样品被故意移离显微镜物镜的焦平面，以允许散焦成像，造成同心圆环。这种被称为“时间聚焦”的方法不仅可以获得试件的2D图像，还可以从散焦环计算出z-位置。延时图像允许捕获被跟踪的粒子的进程，然后作为视频观看或单独检查。

李博士展示了他的发明的力量，并能够跟踪高速运动自助餐厅Roenbergensis.作为单独的图像，可以检查或合并成一个30帧每秒的移动图像

建立显微镜
李博士的显微镜使用激光作为光源，能够发射飞秒范围的脉冲(即10 - 15秒或0.000000000000001秒)。

超短激光脉冲在通过一对棱镜压缩之前，使用光学元件来降低功率。一种叫做光栅的特殊组件将光分成不同的颜色，每一种颜色的光线通过一个透镜进行准直，或者使它们像铁路轨道一样以平行的方式传播。

一种被称为“声光调制器”的设备可以操纵每一束分离的激光彩色光线，然后它通过另外两个透镜将激光脉冲传递到物镜。当所有不同颜色的激光在物镜焦平面上空间重叠时，它们也在时间上重叠，从而实现短激光脉冲。

被检查的受试者被荧光标记，使得在用超快激光脉冲照射之后它们在某些波长处发光。二向色束分离器用于将发光光与激光激光分离。图像和视频由摄像机捕获。可以用差异荧光剂标记不同类型的受试者以允许多个通道成像。

看海洋浮游动物
李博士和他的团队用一种快速移动的海洋浮游动物来测试显微镜的运作。他们选择了Cafeteria roenbergensis，一种d形双鞭毛单细胞生物。鞭毛是一种毛发状的附体，可以让浮游动物在海洋中游动。

直径约10μm，以细菌和浮游植物为食，是海洋细菌的重要捕食者，有助于营养循环，是海洋食物链中的重要组成部分。在实验中，两种颜色的荧光剂被用于标记Cafeteria roenbergensis:绿色和红色，由直径为100nm的小珠子组成。

实验室培养了自助餐厅Roenbergensis.在培养基中，用大肠杆菌细菌是它们的食物来源。对于实验来说，少量的自助餐厅Roenbergensis.从实验室的原料中提取并转移到没有食物的培养基中。饥饿4天后，将稀释的荧光珠添加到培养物中。浮游动物将这些珠子作为食物吞下，可以作为李博士团队显微镜的目标来跟踪它们的运动。他们被保存在一个黑暗的地方，以保存荧光实验。

延时图像采用两台相机，每台相机捕获其中一个荧光颜色，绿色或红色。由LI DR开发的技术意味着每个图像显示有机体在两个维度中的位置，并且在每个图像周围的散焦环推断出第三维度。使用数学模型允许团队计算被跟踪的两种浮游动物的Z位置，由绿色和红色荧光表示，添加到拍摄的其他两个尺寸。

李博士展示了他的发明的力量，并能够跟踪高速运动自助餐厅Roenbergensis.作为可以检查或组合成每秒运动图像的30帧的单独帧。

李博士的新方法可能会在生物学和健康领域带来令人兴奋的发现，因为它将有可能检测病毒等微小生物体与其宿主之间的相互作用

提高显微镜
该团队已经表明，没有必要使用扫描激光在微观尺度上捕获宽视场3D图像，而是使用双光子荧光作为一种方法，并通过时间聚焦来显示目标的z位置。

李博士说，他们的显微镜目前每秒30帧的帧率不是上限，而是他使用的电荷耦合器照相机的结果。他提出，他的团队的方法可以实现毫秒分辨率，甚至更高的速度操作是未来的一种可能性。

李议员的新方法可能导致生物学和健康科学中的激动人心的发现，因为它可能会检测微小生物之间的相互作用，如病毒及其主持人，但这不是他唯一的成就。显微镜不是李博士唯一从这项研究取得的成就;他创建了复杂的数学模型，利用建模软件，产生降噪算法，并从时间聚焦环中获得高精度的Z位置。