提高针对蛋白质复合物的抗体

洛克菲勒大学的约翰·拉卡瓦博士发现，目前可用的靶特异性抗体在分析细胞内蛋白质-蛋白质相互作用方面存在缺口。利用最新的抗体生产技术，加上免疫沉淀和质谱分析，他的目标是确定转录因子和其他与疾病有关的大分子之间的重要相互作用。

蛋白质对细胞的内部运作至关重要。蛋白质分子之间形成了复杂的相互作用网络，由于这些联系驱动着细胞活动，对它们的准确认识对于理解细胞生物学和生物化学是至关重要的。了解特定细胞群中形成的蛋白质相互作用网络的一种方法是通过免疫沉淀——利用免疫系统的分子结合蛋白质，并将它们从溶液中提取出来，以便研究。

牵连
免疫沉淀是一种分子技术，能够提供蛋白质结合的精确图像。这项技术包括打破活细胞以获取其内容物，从而释放一种复杂的蛋白质混合物，然后使用抗体附着在特定的目标蛋白质上，从而捕获它并让它从混合物中分离出来。重要的是，抗体必须能够在靶蛋白与细胞中其他蛋白质形成物理结合的情况下与靶蛋白结合，并且脱靶结合的可能性最小。当操作得当时，免疫沉淀允许从细胞中集体纯化相互作用的蛋白质组。共同纯化蛋白被认为是有关联的。也就是说，如果已知纯化组中的一个或多个蛋白质的生物学功能，其余的蛋白质往往也被证明与相同或相关的生物学功能有关。有了针对每一种人类蛋白质的抗体，研究人员就可以绘制出与生命有关的蛋白质关联的庞大网络。当蛋白质结合出错时，由此产生的相互作用改变可能导致疾病。因此，对这些变化的研究具有很高的临床价值。

蛋白质关联的普查
拉卡瓦博士的工作很重要，因为尽管在基因组特征和蛋白质鉴定方面取得了重大进展，但细胞内蛋白质相互作用的全球网络(称为相互作用组)的特征仍然很差。据估计，目前有10%或更少的人类蛋白质相互作用被绘制出来，而且这个数字不包括最有争议的疾病特异性相互作用。作为他们与CDI实验室公司合作的一部分，拉卡瓦博士的团队目前专注于识别转录因子的相互作用，转录因子是基因表达的主要调控因子，通常涉及癌症进展。这些蛋白的变化通常是导致肿瘤不受调控的增殖的原因，因此了解它们在自然和疾病状态下的关联和活动将有助于确定潜在的治疗靶点。

据认为，目前只有10%的人类蛋白质相互作用被绘制出来

任何有价值的事情都不容易:发现、优化、重复
这项任务是更具挑战性的，因为现在许多抗体不能可靠地捕获其靶蛋白及其相关的互动伙伴的问题。此外，在所有实验条件下，即使是可靠的抗体也可能无法表现良好，并且一旦它们从细胞释放并进行免疫沉淀，细胞中存在的蛋白质关联并非所有同等稳定和分析播种。因此，必须对每种抗体和免疫沉淀实验进行程序验证，劳动密集型和通常耗时的过程。因此，Lacava博士及其在CDI的合作者已经设定了产生和评估一套新的抗体候选者，以及在最佳条件下使用它们来发展稳健的过程。

该过程并不完全直接。细胞内的蛋白质相互作用(体内)存在于一组自然发生的环境参数中。在免疫沉淀过程中，这些条件不可避免地会发生改变，这就需要将细胞的内容物转移到试管内的人工条件中(体外)以便将它们与用于捕获蛋白质的抗体混合。将蛋白质从细胞转移到人工环境中，一个不受欢迎但常见的副作用是，对变化敏感的相互作用的蛋白质群将迅速彼此分离-阻止它们在免疫沉淀过程中共同捕获。因此，这些蛋白质关联无法被检测到(假阴性)。类似地，当真正的相互作用分离时，可能会形成虚假的相互作用，错误地暗示这些虚假的相互作用在与免疫沉淀靶点相关联的生物过程中(假阳性)。

因此，在免疫沉淀期间，互乱组的不同组分需要在免疫沉淀期间在实验中到位是稳健的并且在生理学上准确的结果。为了克服这一点，Lacava博士和他的国家动态互乱研究中心的同事（NCDIR）使用基于质谱的蛋白质组学分析开发了一种高通量筛选方法，允许精确体外绩效的条件分类。它们的结果揭示了免疫沉淀的最佳条件。

有了这些技术，该团队现在正集中精力评估商业可用的针对人类转录因子的抗体，这些抗体是在美国国立卫生研究院(NIH)蛋白质捕获试剂计划(PCRP)下生产的。他们的直接目标是鉴定这些抗体的免疫沉淀蛋白复合物的能力，这些蛋白复合物是在已建立的细胞系中由转录因子形成的。最终，该团队计划使用相同的技术直接从切除的患者肿瘤中纯化转录因子蛋白复合物——探索特定于癌症状态的成分差异。

为生物医学研究人员提供了一个新的工具箱
利用他们的筛选技术、特定的抗体和确定的最佳条件，该团队希望能够为下一阶段的计划捕获一系列复合物。

目前，抗体通常是根据具体情况产生的。例如，在这样的工作流程中，将感兴趣的蛋白质(如重组人类转录因子)注射到老鼠体内，引发免疫反应。然后从小鼠身上获得产生b细胞的抗体，并在实验室中培养，以提供这些抗体的可再生来源。在拉卡瓦博士和CDI的手中，这些抗体在免疫沉淀的有效性测试，如上所述。CDI在该领域取得了重大进展，开发了一种名为Fast-MAb®的专有单克隆抗体生产流水线。然而，总的来说，这仍然是一个昂贵、劳动密集和耗时的过程。

拉卡瓦博士的方法为蛋白质生物化学和亲和蛋白质组学研究中长期存在的、尚未阐明的问题提供了新颖的解决方案

如果这个过程可以加快，会怎么样?为了达到绘制健康和疾病中整个人类相互作用的最终目标，需要针对每一种人类蛋白质和变体的良好抗体。为了解决这个问题，拉卡瓦博士和CDI已经开始将免疫沉淀蛋白复合物注射到小鼠体内，该复合物中含有大量的物理和功能连接的蛋白质。在此过程中，它们同时对混合物中存在的许多蛋白质产生抗体;这些抗体在免疫沉淀中被验证如上所述，并用于挖掘新的蛋白质关联的相互作用-产生一个良性循环。拉卡瓦博士希望以指数方式扩大对相互作用组研究有用的抗体组合，同样地，迅速扩大真正的人类蛋白质-蛋白质关联的覆盖范围。

这种方法也有附加价值。当使用完整的、内源性组装的蛋白质复合物作为免疫原时，产生的一些抗体可能识别作为自然发生的蛋白质加工范围的一部分的变量。这些可能包括可选的异构体和截断、翻译后修饰和仅当蛋白质结合在一起时形成的界面(称为四元结构)。创造能够区分结合和未结合蛋白质，并且只捕获特定蛋白质结合状态下的蛋白质复合物的试剂是该领域的“圣杯”。这种方法的另一个主要好处是产生的抗体以内源性蛋白质形式为靶点。这减轻了对基因修饰细胞的需要，在目标蛋白质上添加亲和标签，以便使用针对标签的抗体来纯化蛋白质复合物。由于现有的天然抗体的稀少性，亲和力标记目前被用于大多数相互作用组的研究。然而，这种方法只广泛适用于模型细胞系，这些细胞系易于在全基因组范围内进行基因操作，从而使更多与疾病相关的临床样本无法使用。总的来说，这项研究的动力是为扩大生物医学研究能力和发现提供工具，同时也提高重现性。

解决老问题的独特方法
因此，拉卡瓦博士的方法为蛋白质生物化学和亲和蛋白质组学研究中长期存在的、尚未阐明的问题提供了新颖的解决方案。利用CDI专有的单克隆抗体生产流水线，使用现有的最大含量、全长人类蛋白微阵列(能够筛选针对近2万个人类蛋白的抗体)，拉卡瓦博士的团队决心进一步扩大目前免疫沉淀技术的可能性，并将其自身带入商业市场。

最终的目标当然是改善病人的治疗效果，开发能够对抗癌症的新药。事实上，研究小组相信，他们获得的完整、纯化的蛋白质复合物将提供一个无与伦比的机会，以测试候选药物在细胞内发现蛋白质时调节蛋白质的能力，并在此过程中治疗疾病。因此，这项研究的好处很可能在诊断和治疗两方面得到认可，因为快速识别肿瘤的生化特征并开发对抗其异常活动的武器变得越来越可能。

参考文献

1. BioCompare抗体市场报告。(2015)。
2. 抗体无政府状态:命令的召唤。大自然。(2015)。
3. Khoo等人。自然评论药物发现。（2014）。