健康与医学

其细胞环境中生物分子的高通量荧光测序

了解健康或患病组织内的分子多样性对于疾病的诊断和治疗以及对基本生物学过程的更好理解至关重要。生物组织包含数千种不同的分子,而传统的染色法一次只能看到少数分子,因为它依赖的染料数量有限。来自哈佛医学院威斯研究所的乔治·丘奇教授和里奇·科曼博士率先使用合成生物学技术,直接在未改变的生物样本上对大量分子目标进行成像。

的FISSEQ图像
未改变的生物样品。
生物组织的研究传统上涉及使用依赖于有限数量的染料的染色技术,只允许在任何时间处理少数分子。这限制了传统技术的诊断潜力以及我们对患有成千上万的分子在健康和患病组织内相互作用的诊断潜力。此外,基因组测序的传统技术能够提供有关存在的基因的信息;然而,它们涉及导致细胞和组织的物理破坏的方案,这意味着关于细胞内每个mRNA位置的关键信息丢失。

为了提高我们对系统生物学的知识和理解,我们面临的挑战将是设计使用互补技术,将下一代测序的解译能力与荧光显微镜的高分辨率潜力结合起来。还需要诊断技术,能够发现细胞结构中特定区域的化学环境的细微变化,以便能够早期诊断和预防一些疾病的晚期发作。

来自哈佛医学院威斯研究所实验室的乔治·丘奇教授和里奇·科曼博士开创并完善了一系列技术,将它们融合成一种统一的方法,能够同时对多个分子目标成像,而不影响其样本的细胞完整性。其结果是一种被称为荧光原位测序(FISSEQ)的技术。In situ是拉丁语,意思是“在适当的地方”,意思是检测技术在细胞未改变的空间环境中工作。

FISSEQ将彻底改变这种方式
我们了解生物学。

基因通过策略性地在细胞室内定位的信使RNA(MRNA)的干预表达蛋白质。因此,重要的是不仅确定MRNA的序列,而且非常重要,但是至关重要的也是它们的位置。FISSEQ背后的想法很简单。将每个mRNA酶促转化为DNA的匹配链,然后将几次乘以几次以产生微小的复制DNA球,仍然附着在原始点上。然后,四个荧光染料,每个DNA碱,使得通过一系列闪蒸的颜色来检测DNA的确切序列,所有这些都在显微镜下。

荧光显微镜可以产生高分辨率的图像。

将FISSEQ应用于蛋白质组的研究
FISSEQ最初被开发用于在完整的细胞内一次性定位数千个信使rna。该技术随后被改进,通过在蛋白质上插入独特的DNA标签,也可以通过上述测序方法检测蛋白质。这可以通过使用与目标蛋白结合的寡核苷酸结合抗体来实现。然后通过FISSEQ在未改变的样品中对共轭核苷酸标签进行测序。计算机设计的被选为标签的寡核苷酸被合成并独特地分配到每个抗体上,就像条形码一样,可以在多个成像轮中被检测到。该团队已经证明,他们的条形码技术在整个老鼠大脑切片上都有效。这项技术很简单,可以同时识别许多条形码蛋白。只需三轮测序,这种方法就可以同时识别64个靶标。相比之下,使用两种传统的荧光染料作为杂交标记只能检测到6个独特的目标。

FISSEQ示意图。利用标记的随机六聚体引物引物M-MuLV逆转录酶,在固定的细胞或组织中生成氨基烯丙基dUTP修饰的cDNA片段。BS(PEG)9永久交联修饰的cDNA和细胞蛋白基质。cDNA循环后,Phi29 DNA聚合酶生成cDNA扩增子。在细胞内的三维原位RNA中,交联扩增子被测序。Sinverso / CC BY-SA

通过FISSEQ的所有变体,有朝一日用户将能够同时可视化数百或数千个蛋白质,从而对它们在细胞结构中的功能提供重要的了解。有趣的是,这项技术使研究人员能够在看似健康的组织中发现蛋白质表达的细微差异。例如,这项技术可以用来识别可能导致早期癌症的危险突变,也可以为阿尔茨海默病(Alzheimer 's Disease)等衰弱疾病的进展提供见解。该技术的最新发展使其能够获得亚细胞室RNA表达的纳米级分辨率成像。作为一个例子,丘奇教授和科曼博士证明他们可以获得老鼠海马神经元的刺和树突内rna的纳米级分辨率图谱。

'写入合成分子签名
FISSEQ将彻底改变我们理解生物学的方式,但它的潜力不限于对自然组织的研究。Wyss研究所的团队也在努力使用合成生物学来设计包含特定分子特征的生物样本,有效地将遗传信息“写入”到复杂的生命系统中。

通过所有FISSEQ的变体,有一天的用户将能够在内部同时可视化数百或数千个蛋白质
细胞结构。

调整这些基因标记的时间和位置,使以前难以研究的过程得以研究。例如,在老鼠体内,细胞可以进行基因改造,使其保持其发育的化学记录,使科学家能够跟踪一系列复杂的分裂和分化事件,使单个受精卵发育成一个完整的有机体。这可以通过一种被称为在活的有机体内条码。在这种技术中,可遗传的随机突变被诱导,因此它们可以在发育过程中积累。虽然在活的有机体内方案中的培养细胞和下脊椎动物中的患者在培养细胞和下脊椎动物中均为第一个在小鼠中携带它的科学家,其中使用与人类健康更相关的模型生物,如开发等许多方面。

大脑条形码:研究人员已经开发了FISSEQ序列条形码,其可以放置在小鼠大脑中以研究神经连接。

转基因老鼠体内的每个细胞都会遗传独特的突变,这些突变会传递给它的子细胞,子细胞会发生进一步独特的突变。在每次细胞分裂事件中,可能的突变数量呈指数级增加,从而产生各种各样的条形码。条形码仍然嵌入后代细胞的基因组中,可以通过测序提取。与距离较远的细胞相比,亲缘关系较近的细胞具有更相似的突变轮廓或条形码,这使得科学家能够确定发育事件的正确谱系。

神经连接研究的新领域
这方面的一个有用应用是,以一种更容易解释连接的方式标记脑细胞的能力。通常,研究人员试图用不同的颜色标记细胞,以便将它们区分开来,但只有少数几种不同的颜色可用。丘奇教授和科曼博士推断,如果颜色被条形码取代,大脑中的每个细胞都可以被唯一识别,因为条形码的数量几乎是无限的。首先,该团队开发了一种功能强大的FISSEQ,用于对条形码进行排序,可以用工程病毒植入小鼠大脑。接下来,他们正在努力更好地定位条形码,以便它们驻留在细胞连接的地方。丘奇教授和科曼博士认为,使用这种测序方法来建立神经连接,将克服当前技术的许多瓶颈,目前的技术依赖于将数千个薄片排列在一起。此外,这种研究神经连接性的方法与所有版本的FISSEQ兼容;因此,连通性可以在观察样品中重要蛋白质和RNA的同时进行研究。

条形码仍然嵌入细胞的基因组中,并且可以通过测序来提取科学家可以比较突变模式的测序来提取。图片:哈佛大学的WYSS学院

我们未来对生命科学的理解的革命
Wyss Institute的教授和Kohman博士认为,在复杂哺乳动物中写入和阅读遗传序列的方法的结合对于未来医学和生物科学的突破是至关重要的。在天然组织组织内单细胞中同时检测数百或数千分子的能力将推进生命科学,药物发育和临床诊断的研究,提供基因组和蛋白质组学分析的下一个大步骤。到目前为止获得的结果是令人鼓舞的,表明合成生物学可能导致研究和治疗发育,神经或精神病疾病的新方法。

个人反应

你们是否计划使用“体内”条形码来理解自闭症、抑郁症或癫痫等疾病背后的机制?

是的,我们对更好地理解神经和精神障碍非常感兴趣。目前对这些疾病的了解还很多,这使得提出有效的治疗和治愈方法具有挑战性。例如,已知所有这些障碍都与大脑连接的改变有关;然而,很难理解这其中的作用,因为目前还没有方法来研究大脑是如何在高分辨率和远距离连接的。我们认为,结合分析在活的有机体内条形码与疾病有关的关键蛋白和核酸将最终导致对大脑病理功能障碍的最佳理解。

本文是在研究团队的批准下创建的。这是一个合作制作,由那些特色的支持,免费援助,全球分发。

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