艰难梭状芽胞杆菌感染：危险因素和潜在疫苗

抗生素治疗是发展风险的主要因素之一艰难梭状芽胞杆菌
（c . diff）感染，每年均负责近500,000个感染和30,000人死亡的病症。Joseph Sharma博士，Ashish Sharma博士及其在国家糖尿病和消化和肾病（Niddk）的生物技术核心实验室（Niddk）的合作者优化了基于的潜在疫苗候选人的过表达的生物处理条件c . diff通过表达它的毒素一个片段大肠杆菌在限制溶解氧浓度下。

艰难梭状芽胞杆菌（c . diff）已成为美国医院的医疗保健相关感染的常见病原体，导致危及生命的腹泻和结肠炎 - 结肠炎症。在美国单独，c . diff负责每年近500,000个感染和30,000人死亡。根据美国疾病控制和预防中心，患者的可能性是7至10倍c . diff在抗生素或不久之后。用抗生素治疗通常伴有胃肠道并发症，特别是老年人。抗生素治疗的持续时间是发展风险的主要因素之一c . diff感染。这是因为通过杀死病原体来对抗细菌感染的抗生素也会伤害肠道菌群中的有益细菌。抗生素耐药c . diff，面对肠菌群的竞争几乎没有竞争，然后可以作为结果茁壮成长，繁衍地繁殖，导致危及生命的症状。

传统治疗c . diff感染包括使用甲硝唑或万古霉素，强的抗生素受到它们的广谱和肠道菌群进一步扰动的影响，这导致了不可接受的高复发率。新出现的免疫疗法，包括单克隆抗体和疫苗c . diff，可能会防止感染。目前没有FDA批准的疫苗，但两个主要制药公司的两个潜在的疫苗候选人在临床试验期间。两种有效蛋白毒素的生产c . diff是造成这种疾病肠道损伤的罪魁祸首这种毒素被称为A和B，是已知最大的细菌毒素。这些潜在的疫苗含有位于c端区域的重复氨基酸序列片段c . diff毒素A，被称为重复单位（Raru）。Raru作为候选疫苗的潜力在动物模型中显示，其中Raru的抗体显示出免疫c . diff并中和了毒素的肠毒性和细胞毒性活性。

美国国家卫生研究院(NIH)下属的国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NIDDK)生物技术核心实验室的Joseph Shiloach博士、Ashish Sharma博士及其合作者，专门从事生物化合物的中试规模生产，以推进疫苗和药物开发等领域的研究。研究小组利用他们的专业知识，开发出了一种显著改善难耐rARU表达的方法。

拉鲁的表达水平
在受限制的溶解氧的情况下，大肠杆菌可以基本上增加。

改善梭菌疫苗靶标的生物处理
和其他重组蛋白一样，rARU的生产可以通过人工操纵基因来实现，这样它的序列就可以在宿主细胞中大量复制和过表达。原核生物是生产重组蛋白最常用的表达宿主之一大肠杆菌（大肠杆菌）.然而，重组梭状芽孢杆菌蛋白的产量在大肠杆菌在标准的生物工艺条件下相当差。

Shiloach博士和沙姆拉博士的团队已经优化了文化条件，并在2020年发表的论文中报道，Raru的表达水平大肠杆菌在溶解氧(DO)供应受限的情况下，可显著增加。在这些条件下，rARU的表达量是传统培养条件下的27倍。在他们的研究中，Shiloach博士、Sharma博士和他们的合作者认为，造成这种特殊现象的一个可能原因是细胞壁结合重复序列的存在，这可能有利于限制性DO的转录，导致这种特定基因表达的增加。

宿主中的Ankyrin样蛋白影响Raru表达
Shiloach博士、Sharma博士和他们的团队证明，rARU蛋白序列中的细胞壁结合基序可能与宿主细胞蛋白相互作用。在这些蛋白质中，有一些起转录抑制的作用。特别是，rARU与一种被称为ulaR的转录抑制因子的相互作用可以通过影响l -抗坏血酸的摄取来影响NADH和戊糖的生物合成。

该研究还表明，微生物宿主中的一些细胞肽充当'ankyrin样蛋白'，其可能与Raru蛋白结合。Ankyrin重复是真核生物中的常见蛋白质基序。该基序由33个氨基酸和名称ankyrin组成，该名称源自希腊词为“锚”，泄露了这种重要氨基酸序列的结构意义。在哺乳动物细胞中发现了含有ankylin的蛋白质，并且显而易见的是，它们参与细胞信号传导和调节，并稳定质膜的结构完整性。作者发现表达了大肠杆菌限制性溶解氧条件下锚蛋白(yahD和ArpA)的表达高于非限制性溶解氧条件下的表达，且较高的锚蛋白表达与较高的rARU表达相关(27倍)。结果表明，较高的rARU表达与rARU的细胞壁结合基元与含锚蛋白重复序列的蛋白的相互作用有关;然而，具体的机制还有待研究。

不受限制的溶解氧下关键代谢物的下调
该团队的重要发现是酶RNA聚合酶和关键代谢物在不受限制的氧气存在下进行下调。可以看到下调路径的细节图1．在不受限制的DO中，核糖体、氨基酸、氨基酰trna和ATP分子的可用性也被下调。能量代谢、中枢代谢和核糖体RNA相关基因的下调与重组蛋白过表达过程中产生的细胞应激反应有关。

另一种可能在不同DO条件下发挥作用的转录调控因子是RNA伴侣分子hfq。这种分子与小的RNA序列结合，参与mRNA的稳定。在本研究中，受限DO时hfq上调1.34倍，从而可能提高rARU的表达水平。

宿主中的酶RNA聚合酶和键代谢物在不受限制的氧气存在下下调。

结束语
由Shiloach博士和Sharma领导的研究人员团队优化了对潜在疫苗候选物Raru的过表达的生物处理条件，免受梭菌性困难的感染，这是对危及生命的腹泻和假膜状结肠炎的细菌病原体。

重组rARU，来自厌氧菌的毒素a的部分片段c . diff有效地表达大肠杆菌只有当细菌在受限制的浓度上生长时才。因此，通过用产生限制的疾病的曝气系统提供生长培养来建立优化的表达。

大型生物反应器需要消耗大量的氧气来维持大多数重组蛋白表达所需的标准30%溶解氧浓度，而限制性溶解氧法需要最少的氧气，提高了5倍的rARU转录，产生了更高的27倍的rARU。

该研究表明，受限制的溶解氧策略联合靶向转录阻遏物的基因工程和'Ankyrin-liming'蛋白可以为缩放生产铺平c . diff毒素A，被证明引发了保护豁免权c . diff正在考虑作为一种可能的疫苗来对抗这种病原体。这也与厌氧来源的重组蛋白或具有细胞壁结合特征的重组蛋白的表达有关。