Clostridium艰难术感染：危险因素和潜在疫苗

抗生素治疗是发展风险的主要因素之一Clostridium艰难术
（C.差异）感染，每年均负责近500,000个感染和30,000人死亡的病症。Joseph Sharma博士，Ashish Sharma博士及其在国家糖尿病和消化和肾病（Niddk）的生物技术核心实验室（Niddk）的合作者优化了基于的潜在疫苗候选人的过表达的生物处理条件C.差异通过表达它的毒素一个片段大肠杆菌在限制溶解氧浓度下。

Clostridium艰难术（C.差异)已经成为一种常见的病原体，导致美国医院的医疗相关感染，导致危及生命的腹泻和结肠炎(一种结肠炎症)。仅在美国，C.差异负责每年近500,000个感染和30,000人死亡。根据美国疾病控制和预防中心，患者的可能性是7至10倍C.差异在服用抗生素或不久后。抗生素治疗通常伴随胃肠道并发症，特别是在老年人中。抗生素治疗的持续时间是发病的主要危险因素之一C.差异感染。这是因为通过杀死病原体来对抗细菌感染的抗生素也会伤害肠道菌群中的有益细菌。抗生素耐药C.差异，面对肠菌群的竞争几乎没有竞争，然后可以作为结果茁壮成长，繁衍地繁殖，导致危及生命的症状。

传统的治疗方法C.差异感染包括使用甲硝唑或万古霉素，强的抗生素受到它们的广谱和肠道菌群进一步扰动的影响，这导致了不可接受的高复发率。新出现的免疫疗法，包括单克隆抗体和疫苗C.差异，可能会防止感染。目前没有FDA批准的疫苗，但两个主要制药公司的两个潜在的疫苗候选人在临床试验期间。两种有效蛋白毒素的生产C.差异是造成这种疾病肠道损伤的罪魁祸首这种毒素被称为A和B，是已知最大的细菌毒素。这些潜在的疫苗含有位于c端区域的重复氨基酸序列片段C.差异毒素A，被称为重复单位（Raru）。Raru作为候选疫苗的潜力在动物模型中显示，其中Raru的抗体显示出免疫C.差异并中和了毒素的肠毒性和细胞毒性活性。

美国国家卫生研究院(NIH)下属的国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NIDDK)生物技术核心实验室的Joseph Shiloach博士、Ashish Sharma博士及其合作者，专门从事生物化合物的中试规模生产，以推进疫苗和药物开发等领域的研究。研究小组利用他们的专业知识，开发出了一种显著改善难耐rARU表达的方法。

rARU的表达水平
在受限制的溶解氧的情况下，大肠杆菌可以基本上增加。

改进梭菌疫苗靶点的生物加工
和其他重组蛋白一样，rARU的生产可以通过人工操纵基因来实现，这样它的序列就可以在宿主细胞中大量复制和过表达。原核生物是生产重组蛋白最常用的表达宿主之一大肠杆菌（大肠杆菌）。但是，产生的重组梭菌蛋白的产量大肠杆菌在标准生物过程条件下相当差。

Shiloach博士和沙姆拉博士的团队已经优化了文化条件，并在2020年发表的论文中报道，Raru的表达水平大肠杆菌在溶解氧(DO)供应受限的情况下，可显著增加。在这些条件下，rARU的表达量是传统培养条件下的27倍。在他们的研究中，Shiloach博士、Sharma博士和他们的合作者认为，造成这种特殊现象的一个可能原因是细胞壁结合重复序列的存在，这可能有利于限制性DO的转录，导致这种特定基因表达的增加。

宿主中的Ankyrin样蛋白影响Raru表达
斯科尔巴博士及其团队博士表明，Raru蛋白质序列中的细胞壁结合基序可能与宿主细胞蛋白相互作用。这些蛋白质中的一些是作为转录的阻遏物。特别地，Raru与称为ular称为ular的转录抑制剂的相互作用可以通过影响L-抗坏血酸的摄取来影响NADH和戊糖糖的生物合成。

这项研究还表明，微生物宿主中的一些细胞肽充当“锚蛋白样蛋白”，可能会与rARU蛋白结合。锚蛋白重复序列是真核生物中一种常见的蛋白质基序。这个基序由33个氨基酸组成，而“锚”这个名字，源于希腊单词“锚”，揭示了这个重要氨基酸序列的结构意义。在哺乳动物细胞中发现了含有锚蛋白的蛋白质，很明显，它们参与了细胞信号传递和调控，并稳定了质膜的结构完整性。作者发现大肠杆菌在限制溶解氧的限制溶解氧时较高，并且在不受限制的溶解氧下较高，并且较高的kyrin表达与较高的Raru表达（27倍）相关。结果确定较高的Raru表达与Raru中细胞壁结合基序的相互作用与含有蛋白质的胰蛋白质重复;但是，需要调查具体机制。

在不受限制的溶解氧下的关键代谢物下调
该团队的一个重要发现是，RNA聚合酶和关键代谢物在不受限制的氧气存在下下调。下调途径的细节可以在图1．在不受限制的DO中，核糖体、氨基酸、氨基酰trna和ATP分子的可用性也被下调。能量代谢、中枢代谢和核糖体RNA相关基因的下调与重组蛋白过表达过程中产生的细胞应激反应有关。

另一种可能在不同DO条件下发挥作用的转录调控因子是RNA伴侣分子hfq。这种分子与小的RNA序列结合，参与mRNA的稳定。在本研究中，受限DO时hfq上调1.34倍，从而可能提高rARU的表达水平。

在不受限制的氧气存在下，宿主体内的酶RNA聚合酶和关键代谢产物都下调。

结束言论
由Shiloach博士和Sharma领导的研究人员团队优化了对潜在疫苗候选物Raru的过表达的生物处理条件，免受梭菌性困难的感染，这是对危及生命的腹泻和假膜状结肠炎的细菌病原体。

重组rARU，来自厌氧菌的毒素a的部分片段C.差异在大肠杆菌只有当细菌在限定的DO浓度下生长时。因此，通过向培养菌提供产生限制性DO条件的曝气系统，建立了优化表达。

虽然大型生物反应器消耗大量氧气以维持大多数重组蛋白表达所需的标准30％溶解氧浓度，但受限制的溶解氧方法需要最少的氧气，并通过5倍改善Raru转录并产生27倍大量的raru。

这项研究表明，限制溶解氧策略结合针对转录抑制子和“锚蛋白样”蛋白的基因工程，可能为规模化生产铺平道路C.差异毒素A，被证明引发了保护豁免权C.差异并且正在考虑作为对该病原体的可能疫苗。它还与来自厌氧来源的重组蛋白的表达或具有细胞壁结合谱的那些。