利用点击化学技术制造出第一个功能正常的合成DNA

点击化学彻底改变了我们创造定制蛋白质的能力，那么它对DNA也能起到同样的作用吗?牛津大学的Tom Brown教授和牛津大学和苏伊士大学的Afaf El-Sagheer教授正在进行真正具有开创性的研究，将“点击化学”生物结合技术应用于DNA。他们的技术允许创造比任何其他化学合成途径更大的DNA和RNA结构，比使用酶更灵活。这是由于在大肠杆菌和人类细胞中，一种与操纵dna的细胞机制生物相容的新型化学联系。

几乎每隔一段时间观察，实验或发现改变的不仅仅是科学认识更多。达尔文，哥白尼，牛顿的突破，而科学，也对哲学，宗教和形而上学意义。

也许弗里德里希Wöhler 1828年的发现——尿素可以由氰酸钾和氯化铵制成——也应该包括在这个列表中。尿素，用他自己的话说，是一种“动物物质”，是第一种没有任何生物原料的创造，标志着活力论的终结。

在Wöhler之后的几十年里，使用纯化学方法创造的生物化学物质的清单越来越长，而分子本身也变得更大、更复杂。早期显著的进步包括葡萄糖、维生素B12和胰岛素;最近，更大的分子已经成为可能，包括化疗，抗生素，甚至蛋白质。但是，尽管我们取得了进展，仍然没有有效的化学合成方法来合成可能是最著名的生物分子:长DNA。

构建DNA序列的现代技术包括使用生物酶将合成的DNA短段连接在一起，称为“寡核苷酸”或“oligos”。多个寡聚体可以组装成基因和质粒。

低聚糖几乎都是用固相磷酰胺法生产的。这种方法的错误率相当低——足以创建通常在100个碱基左右的寡聚体。然而，在150垒左右，错误开始成为一个问题。因此，长片段的DNA需要大量的寡聚体，这就需要复杂的生化技术。

化学结扎
自2007年以来，Afaf埃尔 - Sagheer和汤姆·布朗已经开拓的另一种方法的大DNA和RNA链的化学合成。他们的前提是较长寡核苷酸可以使用化学连接，而不是酶连接短寡核苷酸被创建。

但这并非易事:这些化学“链接”不可能是自然DNA中发现的磷酸酯链接的精确复制品。相反，这些DNA复制品中的化学连接需要是“生物兼容的”——与天然酶和真实的东西难以区分。

El-Sagheer和Brown的三唑键是利用化学合成形成的生物相容人工DNA链的一个独特例子。

寻找其产生的生物相容性化学键的化学反应是在El-Sagheer和布朗的工作的一个重要里程碑。研究人员在大纲2009年的研究，他们如何使用“点击化学”，一组已知有效地形成生物分子和其他分子，被称为生物结合的过程之间的结合化学反应。

CuAAC
El-Sagheer和Brown开始开发一种“铜(I)催化叠氮炔环加成”(CuAAC)的变体，以寻找一种适合连接低聚物的方法。CuAAC是“经典的”点击化学反应，被点击化学技术的先驱Sharpless描述为“点击反应的首要例子”。CuAAC产生了一个三唑键——一个由两个碳原子和三个氮原子组成的五元环。最初的实验表明，使用CuAAC将两个带有三唑键的T核苷酸连接起来，可以将各种低聚物结合起来。

这些低聚物随后使用PCR进行“扩增”——用于复制DNA序列的生化过程。在PCR中，含有三唑键的低聚物分子需要被DNA聚合酶“读取”，DNA聚合酶是复制过程中的关键酶。如果三唑键是生物相容性的，那么PCR过程应该产生低聚物序列的副本。这些复制体不包含三唑键。

CuAAC的局限性
然而，这个版本的CuAAC反应有其局限性。在PCR中，DNA三唑链被DNA聚合酶读取，读取过程缓慢，导致三唑周围两个核苷酸中的一个缺失。T-三唑-T序列在PCR产物中转化为单个的T。换句话说，这种连接与天然DNA中发现的磷酸二酯连接不是很相似。此外，在结扎步骤中，很难用正确的两端前体产生寡聚体。

虽然一个碱基缺失，卓越的成就是在PCR过程中，在第一时间，成功地扩增含有三唑 - 连接 - 低聚物。

发展更好的联系
随着生物相容性的前景，El-Sagheer和Brown开始重新设计类似的连接，将他们的技术应用于DNA和RNA。

在2010年的工作中，他们证明了一个重新设计的三唑键可以用来合成核糖酶，核糖酶是一种由RNA形成的细胞机制。RNA在许多方面与DNA相似——它是一种由核酸组成的聚合物——但它确实有一些关键的区别，这使得长RNA链比DNA更难合成。至关重要的是，RNA在糖上含有一个额外的羟基，如果它在固相合成和去保护过程中得不到保护，就会导致不必要的副反应。这个羟基也是一个“空间位阻”，这意味着它在物理上阻碍了接近成键位置的分子。

因此，在纯状态下很难产生超过50个核苷酸的RNA链，这与核糖酶和核糖开关等生物功能RNA结构的长度不太接近。

通过CuAAC反应，El-Sagheer和Brown能够将分离的低聚体链交联在一起，形成两个RNA结构，都有近100个核苷酸长。这两种结构——带有交联的发夹状核酶和活性位点有改进链接的锤头状核酶——的功能与它们的天然等效物一样。

建立于2010年在RNA的新键的生物相容性后，这种改进联动用于结扎3 100个碱基长度的低聚物来构造的长度为300个碱基的DNA分子，并扩增采用PCR。所得序列的分析证实了新三唑连接的生物相容性：将DNA准确地复制，与包括在低聚物上的副本的三唑连接的两侧核苷酸。

体内研究
然而，生物相容性的真正测试是在细胞内部。在与南安普顿大学Ali Tavassoli和Pia Sanzone的一项重要合作中，低聚体使用CuAAC连接，形成一个含有三唑的DNA片段，已知的抗生素耐药性编码，并插入到大肠杆菌细胞的DNA中。

在含有氨苄西林的琼脂皿中过夜的培养揭示了研究小组所希望的结果:添加了三唑DNA的皿中含有96.5%的菌落;在阴性对照中，这一比例仅为1.6%。换句话说，被注入人工DNA的大肠杆菌细胞被证明对抗生素具有耐药性，而三唑环与大肠杆菌的细胞机制具有生物相容性。

在Wöhler合成尿素的200年之后，无酶合成长DNA——或者至少是对长DNA的功能模拟——现在已经成为可能。

在缺乏DNA修复酶的大肠杆菌细胞上重复试验，获得了相似的存活率，这表明成功并不是因为大肠杆菌“纠正”了连接。这种连接确实与dna阅读酶具有生物相容性。

满足CRISPR的要求
El-Sagheer和Brown的三唑键是利用化学合成形成的生物相容人工DNA链的一个独特例子。在Wöhler合成尿素的近200年后，利用点击化学，无酶合成DNA——或者至少是功能模拟DNA——现在成为可能。

一个领域，这项技术可以Excel在CRISPR基因编辑的新兴市场和发展前景的技术。该技术依赖于创建称为单导的RNA（sgRNAs）RNA序列。当CRISPR-Cas9离开实验室并进入诊断和治疗用途，sgRNAs将有很高的需求。但目前使用的酶的产生sgRNAs库是既费时，不易结垢。

这些短段RNA由两部分组成。首先，一个约80个核苷酸长的片段，与Cas9蛋白结合，并且在所有sgRNA分子中都是相同的。第二，一个大约20个核苷酸长的片段，它是DNA序列中在应该进行编辑的地方所特有的。这将引导Cas9蛋白到达DNA分子的正确位置。

在他们发表在自然通信2019的研究，该组中详述的CuAAC反应如何可以用来产生sgRNAs的文库在单管 - 通过连接使用点击化学因组低聚物的两个部分。使用这种技术的优点在于，Cas9结合低聚物可以在大规模生产，这意味着进行调整仅20个碱基的寡聚体的需求，并且两半可以连接。

由此产生的sgRNA允许在细胞中进行基因编辑，没有意外的脱靶效应。也许CRISPR将是三唑键在DNA化学中留下标记的地方。